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ISSN : 1229-3571(Print)
ISSN : 2287-819X(Online)
Korean Journal of Organic Agricultue Vol.26 No.4 pp.649-660
DOI : https://doi.org/10.11625/KJOA.2018.26.4.649

Selection of Antifungal Bacteria Burkholderia lata CAB13001 for Control on Red Pepper Anthracnose and Its Control Efficacy in Field

Soo-Sang Hahm**, Byung-Ryun Kim***, Mi-Kyung Kwon***, Kwang-Seop Han***, In-Hee Park***, Kyung-Won Seo****
Corresponding author 충청남도농업기술원 친환경농업과(hahmsoo@korea.kr)
20180814 20181017 20181022

Abstract


To control the pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum, antifungal bacterium strains which was selected among bacterium from natural soil, was tested the antimicrobial activity against various pathogens and its control efficacy on anthracnose disease in the fields. We confirmed that antagonistic activity of CAB13001 strain to pathogens such as Sclerotinia cepivorum, Sclerotinia sclerotium and Botrytis cinerea including Colletotrichum acutatum was remarkable superior with the dual culture method in the artificial medium. In vitro bioassay using the green pepper fruit, CAB13001 strain suppressed the lesion development of Anthracnose disease, and its control value compared to the untreated one was 82.4% on pepper fruit in field test. These results suggested that CAB13001 strain could be a very useful biological control agents to anthracnose disease caused by air born plant pathogens of pepper. By the way, analysis of nucleotide sequence of the gene 16S rDNA, antagonistic bacterium CAB13001 strain used in this study was identified as Burkholderia lata.



고추 탄저병 방제제 Burkholderia lata CAB13001 선발 및 포장방제 효과

함 수상**, 김 병련***, 권 미경***, 한 광섭***, 박 인희***, 서 경원****
***충청남도농업기술원 친환경농업과
****전라북도농업기술원 농식품개발과

초록


    Rural Development Administration
    PJ01253006

    Ⅰ. 서 론

    친환경농산물 생산은 2001년 이후 연평균 30%씩 성장하여 지난 15년간 무농약 재배를 포함한 유기재배 면적이 45배 성장하였는데 이는 전체 농산물 대비 4.5% 수준이다. 즉 2010 년부터 저농약 농산물 신규 인증 중단으로 무농약 이상 인증은 증가하는 추세이었으나 취 약한 생산기반, 부실인증 등의 이유로 전체적으로 감소하였다가 2016년에는 전년대비 인증 면적과 농가수가 각각 5.8%, 3.2% 증가하는 반등을 보였다(국립농산물품질관리원 친환경인 증통계정보, 2017). 고추 탄저병을 일으키는 병원균은 Colletotrichum gloeosporioides 등 5종 이 보고되었으나(Park and Kim, 1992), Kang 등(2005)은 ITS 영역의 DNA 상동성 비교와 종 특이적인 primer를 이용한 PCR을 이용한 분석으로 고추 탄저병의 주된 병원균은 C. acutatum 이라고 보고한 바 있다. 고추 탄저병은 과실이 달린 7월 이후 잦은 강우로 포자분산이 활발 하고 높은 습도가 유지되기 때문에 발생밀도는 급격히 증가하여 매년 국내 총생산액의 10% 이상, 중국의 경우 약 18%의 수량손실이 보고되고 있으며(Kim and Park, 1988;Shin et al., 1999), 방제 또한 수확기까지 10회 이상의 약제 살포를 하는 것이 농가 현실이며(Park et al., 2012; Lee et al., 2014; Soh et al., 2014), 이러한 이유로 오랫동안 고추를 재배한 농가 의 경우 약제내성으로 인한 경제적 피해가 점차 커질 뿐만 아니라 잔류농약에 의한 인체에 심각한 질병을 초래하는 등 사회적인 문제가 대두되고 있다(Yoo et al., 2012). 따라서 고추 생산농가의 품질 고급화와 건전한 환경보존을 위해서는 친환경 재배가 유력한 대안으로 대 두되고 있다. 생물농약 등록규정이 2001년에 마련되었고, 지금까지 유기농 고추 생산을 위한 병해관리 기술로 탄저병 저항성 품종 육종이 진행 중이지만 병해방제를 위한 전용 생물농약 (미생물제제) 개발에 대한 연구는 아직까지 많지 않고 현장에서 사용되는 제품의 경우 극소 수에 불과한 실정이다. Lim 등(2006)은 토양에서 분리한 방선균 Streptomyces griseofuscus 200401을 이용하여 고추의 생육촉진뿐 아니라 역병 발생 억제효과를 증명한 바 있고, Kim 등(2011)은 Myxococcus 속균을 이용하여 고추 탄저병균에 길항효과가 있는지를 검토하였으 며, Kang 등(2015)은 고추 재배토양에서 분리한 Bacillus sp. KBC1004균주를 원제로 탄수화 물과 증량제를 포함한 수화제 형태로 개발하여 500배로 희석하여 포장에 살포하였을 때, 방제가는 80.3%로 화학약제의 방제가의 93.1%에 이르는 높은 효과가 있음을 보고하였다.

    현재까지 병해관리용 유기농업자재로 등록된 품목은 모두 176종이며, 이중 미생물과 미 생물 추출물이 51종이고, 고추에 등록된 것은 48종이나 고추 탄저병으로만 적용할 수 있는 품목은 1개에 불과한 실정이다(국립농산물품질관리원 친환경인증통계정보, 2017). 따라서 본 연구는 화학농약을 대체할 수 있는 토착 길항미생물을 이용함으로써, 잔류 농약으로 인 한 농업 생태계 혼란을 사전에 차단하고 환경 친화적 방법으로 고추 탄저병 등 주요 병해 방제에 효과적으로 이용하고자 하였다.

    Ⅱ. 재료 및 방법

    1. 미생물 분리 및 항균활성 검정

    고추 탄저병에 대한 길항효과가 우수한 미생물을 분리하기 위해 충남의 당진, 예산, 홍 성, 서산, 아산 지역의 대나무 숲과 야산에서 부엽토 250점을 채집하였다. 균 분리를 위해 NA (Nutrient Agar, Difco) 배지에서 희석평판배양법을 통하여 세균을 순수 분리하였고, 분 리된 세균은 20% 글리세롤이 첨가된 NB (Nutrient Broth, Difco) 배지에 혼합하여 -70℃에 넣어 보관하여 사용하였다. 미생물의 항균활성을 검정하기 위해 한 개의 페트리디쉬 안에 고추 탄저병균(Colletotrichum acutatum)과 분리된 세균을 함께 배양하는 대치배양을 통하여 그 결과에 따라 길항력이 우수한 균을 선발하였다. 또한 선발 미생물의 적용범위를 밝히기 위해 작물에 병을 일으키는 주요 병원균인 흑색썩음균핵병균(Sclerotinia cepivorum), 균핵병 균(Sclerotinia sclerotiorum), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)을 각각 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) 배지에 대치 배양하여 마찬가지로 길항력을 검정하였다.

    2. 선발 미생물 동정 및 특성검정

    고추 탄저병균을 포함한 작물 주요 병원균에 길항효과가 우수한 미생물의 정확한 종 동 정을 위해 27f (5ʹ-GTG CTG CAG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3ʹ)와 1492r (5ʹ-CAC GGA TCC TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT T-3ʹ) primer를 이용하여 rDNA 16S 유전자 영역을 증폭하여(Frank et al., 2008) 계통을 분석하였다. 분석된 염기서열(1,423bp)은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 염기서열을 비교 분석하였으며, Burkholderia 속 다른 종의 염기서열과 함께 Kumar 등(2018)이 개발한 MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version X) 프로그램 을 사용하여 phylogenetic tree를 작성하였다. 또한, Hildebrand 등(1988)의 방법으로 mineral salt agar에서 arabinose, glucose, mannitol, pratinose, rhamnose, sucrose 및 trehalose 등에 대한 당 이용성을 조사하였으며, 선발 미생물이 다른 작물에 대해 병원성이나 독성을 발현하는 지 검정하기 위해 무, 파, 콩, 참깨를 NB 배지에 배양된 CAB13001 균주에 침지한 후 종자 의 발아상태를 관찰하였다.

    3. 생체 접종 및 포장시험

    선발된 미생물이 고추 탄저병에 방제효과를 나타내는지 검정하기 위하여 실내와 포장에 서 각각 시험을 수행하였다. 기내 간이검정은 충남농업기술원 원내 포장에서 재배한 풋고 추의 과실을 깨끗이 씻어 여과지를 바닥에 깔고 멸균수를 넣은 페트리디쉬에 치상한 다음 알코올 램프로 화염 소독한 백금니로 상처를 내었다. 미생물 배양액은 1×107 cells/ml 농도 로 희석하여 분무기로 고추에 골고루 뿌린 후 물기가 마를 때까지 기다린 다음 PDB 배지 에서 배양된 탄저병 균체를 거즈로 거른 분생 포자액(106/ml)을 상처부위를 포함하여 과실 전체적으로 골고루 분무한 것과 미생물 배양액을 처리하지 않고 분무한 것을 각각 3반복으 로 수행하면서 7일 동안 병 발생 정도를 관찰하였다. 한편, 포장에서의 효과 검정시험은 시 험포장내 고추 과실에 병징이 관찰되는 즉시 NB 배지에서 자란 배양액을 1×107cell/ml 농도 로 희석하여 7일 간격으로 3회 식물체 전면에 살포하였다. 시험에 사용된 고추의 품종은 “배로따”를 사용 하였으며, 미생물 처리구와 무처리, 대조약제(화학농약) 처리구를 난괴볍 3반복으로 수행하였고 대조약제로는 프로피네브 수화제(40kg/10a)를 처리하였으며, 살포 시 기 및 횟수는 미생물 처리구와 동일하게 하였으며, 최종 약제처리 7일 경과 후 처리구별 병 든 과실비율을 조사하였고, 방제가는 다음과 같이 계산하였다.

    방제가(%) = 1- 처리구 발병률 무처리구 발병률 × 100

    Ⅲ. 결과 및 고찰

    1. 고추 탄저병 길항미생물 선발

    고추 탄저병에 항균활성 효과를 나타내는 미생물을 선발하기 위해 천연 부엽토 등으로부 터 미생물을 분리하여 고추 탄저병균과 대치배양을 통해 길항력이 우수한 세균만을 분리하 고자 하였다. 세균의 순수 분리하는 과정에서 우선 선발한 CAB13001을 포함한 4균주에 대 해 고추 탄저병균, 마늘 흑색썩음균핵병균, 상추의 균핵병균, 잿빛곰팡이병균과 각각 대치 배양한 결과, 페트리디쉬 내 형성된 저지원의 직경이 각각 30 mm, 25 mm, 15 mm, 25 mm 로 가장 균사 생장 억제효과가 우수한 CAB13001 균주를 최종 선발하였다(Table 1, Fig. 1).

    한편 RW12304 균주 역시 주요 병원균에 대한 길항효과가 비교적 우수한 것으로 보이나 배양과정에서 방선균으로 진단되었는데, 방선균의 경우 균사 형성이 풍부하여 포장에서 배 양액 살포 중 노즐이 막히는 등 실용화 부분에서 여러 가지 문제점이 선행연구에서 도출되 었으므로 선발에서 제외하였다.

    Han 등(2013)은 위와 동일한 방법으로 마늘의 흑색썩음균핵병균에 대한 미생물 Burkholderia pyrrocinia CAB08106-4의 항균 활성효과를 검정하였고, Yoo 등(2012)도 Colletotrichum속 3 종에 길항효과가 우수한 Bacillus sp. NAAS-1 균주를 같은 방법으로 선발하였으며, Kim 등 (2017)은 배추의 무름병균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum의 펙틴 분해효 소를 불활성화 시키는 방법을 이용하여 미생물 Bacillus toyonensis CAB12243-2를 선발한 바 있다.

    2. 미생물 동정 및 균주특성

    선발된 미생물 CAB13001 균주는 계통학적으로 종을 분류하기 위해 16S ribosomal RNA (rDNA) gene 염기서열(1,423bp)은 NCBI의 GenBank에 제출(등록번호 MH022722)하여 계통학 적 위치를 확인한 결과 Burkholderia속의 종을 포함하는 그룹에 속하는 균주로서 Burkholderia lata (FJ784128)의 16S rRNA 염기서열과 99%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인하였다(Fig. 2). 따라서 이 균주는 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 기탁하여(기탁번호 KACC92026) Burkholderia lata CAB13001로 명명하였으며, 또한 특허출원을 거쳐 고추 탄저병 방제제 Burkholderia lata로 등록(특허등록번호 제10-1761877) 하였다.

    한편 B. lata CAB13001 균주를 NA 배지에 접종한 후 28℃에서 3일간 배양한 다음 콜로 니의 형태적 특성을 관찰한 결과, 원형(circular)의 유백색으로 이중의 단면(umbonate)을 가 지고 있었고(Fig. 3), 선발된 길항미생물이 무, 파, 콩, 참깨에 독성을 나타내는지를 검정하 기 위해 B. lata CAB13001 균주에 침지 처리한 후 종자의 발아 상태를 관찰한 결과, 증류수 처리와 비교하여 거의 동일한 발아율을 보임으로 선발된 균주는 타과 작물에 독성이 없음 을 알 수 있었다.

    선발균주의 영양요구도를 검정하여 대량 배양기술에 접목하는 산업화가 가능한지를 검 토하기 위해 B. lata CAB13001 균주의 탄소원으로서 당 이용성을 분석한 결과 arabinose, mannitol, pratinose, rhamnose는 이용하지 못하였고, trehalose, sucrose, glucose는 이용하여 증 식이 가능하였는데 이는 세균 증식용 NB, LB, KB, TSB 배지에서도 48시간동안 배양한 후 셀의 농도를 측정하였을 때 모든 배지에서 1.0~4.5×109 농도로 배양이 됨으로써 일반적인 세균 배지에서 충분히 증식할 수 있음을 확인하였다(Table 2). Narisawa 등(2000)은 H. chaetospira를 이용한 배추뿌리혹병을 방제하는 연구에서 배추의 뿌리조직으로부터 접종한 길항균을 다시 분리하였는데, 본 시험에서는 시설 하우스 내 고추 잎과 과실에 처리한 B. lata CAB13001 배양액을 50일후에 수확한 고추 과실 표면으로부터 다시 분리하였으며, 분 리된 미생물은 그림 1과 동일한 방법으로 고추 탄저병균과 대치 배양하여 길항효과를 재확 인 하였다(Table 2). 이러한 결과는 시험에 사용된 미생물이 7월 중순 시설 하우스 내 최고 온도 40℃에 이르는 고온에서도 안정적으로 정착하고 생존하였음을 입증하는 것이다.

    4. 풋고추 탄저병 발병 억제

    B. lata CAB13001 균주의 배양액을 이용하여 고추 탄저병을 방제할 수 있는 적정 처리농 도와 처리시기를 찾고자 시설 하우스재배에서 채취한 고추 과실에 상처를 내어 탄저병균을 접종하고 미생물 배양액을 처리하여 병 발생 억제효과를 검토하였다. B. lata CAB13001 배 양액을 처리한 직후 탄저병균을 접종하였을 때 과실 1개당 병반 수는 평균 1.5개이며, 무처 리 3.1개에 비하여 병반 수가 적었고 병반의 크기도 훨씬 작은 것으로 조사되었다(Fig. 4). Kang 등(2015)에 의하면 고추 탄저병 방제를 위해 개발된 KBC1004 수화제로 만든 제품은 살포 후 최소한 24시간이 지나야 미생물이 활성화되어 탄저병의 포자발아를 억제하기 때문 에 풋고추를 이용한 탄저병 발병억제 간이 검정 시 수화제를 처리하고 24시간 후에 병원균 을 접종하였을 때 극히 일부만 병반이 형성되고 대부분은 병반이 확대되지 않는 결과를 얻 었는데 이는 제형화된 수화제의 경우 모두 내생포자 상태로 존재하기 때문에 수분을 흡수 하여 활성화되기까지 최소 24시간이 필요하며, 결국 병원균이 침입하기 전에 미생물이 식 물체에 선점하여 높은 밀도를 유지하는 것이 매우 중요하다는 의미로 해석할 수 있다. 하 지만 본 시험에서 사용된 B. lata CAB13001 균주의 경우는 제품으로 만들어지기 전인 활성 화된 미생물의 배양액을 접종하였기 때문에 빠른 시간에 과실의 표면에 정착하여 발아한 탄저병균의 균사 생장을 억제하였던 것으로 추정된다.

    5. 포장 실증

    충남농업기술원내 고추 탄저병이 상습적으로 발생하였던 포장에 전년도 이병체의 잔유 물을 그대로 방치한 후 정식하여 탄저병 발생을 조장하였다. 미생물과 화학농약 처리구에 탄저병이 관찰된 직후 7일 간격으로 3회 처리하였고 마지막 살포 7일 후 병든 과실비율을 조사한 결과 무처리, 미생물, 화학농약 처리구에서 각각 12.7%, 2.0%, 0.2% 발병하였고, 방 제가는 미생물과 화학농약 처리구에서 각각 84.2%, 98.4%로 높은 방제효과를 나타내었다 (Table 3, Fig. 4). 하지만 발병률 조사를 마치고 20일이 경과하였을 때 강우가 지속적으로 내리면서 무처리구에서는 60%이상, 미생물과 화학농약 처리구에서도 20% 이상의 발병률 을 나타내었다. 이러한 결과는 탄저병의 발생과 확산은 강우와 이에 따른 일조량, 습도와 온도와 밀접한 관계가 있다는 선행연구내용과 일치하였는데(Kwon et al., 2002;Kang et al., 2005), 포장에서의 방제효과를 높이기 위해서는 기상상황에 따라 화학농약의 사용과 같은 방법으로 비가 내리기 전후에 살포하는 것이 중요하며, 더불어 이병 잔재물 제거 등 포장 을 청결하게 유지하는 종합적인 관리가 고추 탄저병 방제에 효과적이라 판단된다. 이상의 결과들을 종합해 보면 B. lata CAB13001은 고추 탄저병균을 포함한 주요 병원균에 적용이 가능한 방제범위가 넓으며, 고온의 시설 하우스 내 식물체 조직에 정착과 생존이 용이하여 작물의 재배기간 동안 지속적으로 방제가 가능하므로 화학농약을 대체할 수 있는 매우 유 용한 미생물제제라 판단된다. Fig. 5

    Ⅳ. 적 요

    Colletotrichum acutatum에 의해 발생하는 고추탄저병을 방제하기 위해 토양 근권으로부 터 분리한 미생물 중 길항효과가 있는 미생물을 선발하여 주요 작물병원균에 대한 항균활 성 효과와 포장에서의 방제효과를 검정하였다. 기내 대치배양법을 이용한 길항력을 검정하 였을 때, CAB13001 균주는 고추 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutatum을 포함한 식물 병원균 Sclerotinia cepivorum, Sclerotinia sclerotium, Botrytis cinerea에 대한 뛰어난 항균활성 효과를 보였다. 또한 풋고추를 이용한 생체 검정에서 선발균주는 고추 탄저병의 병반진전 억제효과가 우수하였으며, 포장에서의 방제가 역시 무처리 대비 82.4%로 매우 우수하였다. 이러한 결과로 볼 때 CAB13001 균주는 공기 전염을 하는 고추 탄저병의 생물적 방제제로 매우 유용할 것으로 판단된다. 한편, 본 연구에 사용된 길항미생물 CAB13001 균주는 16s rRNA gene의 계통학적 위치를 분석한 결과 Burkholderia lata로 동정하였다.

    Figure

    KJOA-26-649_F1.gif

    Antifungal activity of B. lata CAB13001 isolate against various plant pathogens.

    KJOA-26-649_F2.gif

    Phylogenetic tree based on comparison of the 16S rDNA sequence indicating the position Burkholderia lata CAB13001. The phylogenetic tree was generated using the neighbor-joining method. Bootstrap values, expressed as percentages of 1,000 replications, are given at branching points. Bar shows two nucleotide substitution per 1,000 nucleotides.

    KJOA-26-649_F3.gif

    Colony morphology of Burkholderia lata CAB13001 on Nutrient agar.

    KJOA-26-649_F4.gif

    Pepper fruits untreated (A) and treated (B) with antifungal bacterium Burkholderia lata CAB13001 isolate to fruits inoculated by Colletotrichum autatum.

    KJOA-26-649_F5.gif

    Typical symptoms of anthracnosis on pepper caused by Colletotrichum gloeosporioides (A), and antifungal activity of Burkholderia lata CAB13001 in fields.

    Table

    Inhibition of selected isolates against mycelial growth of major plant pathogens

    Biological characters of B. lata CAB13001 isolate in vitro and vivo

    Control efficacy of B. lata CAB13001 isolate and chemical fungicide against anthracnose on pepper fruit during growing seasons

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