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ISSN : 1229-3571(Print)
ISSN : 2287-819X(Online)
Korean Journal of Organic Agricultue Vol.26 No.4 pp.661-676
DOI : https://doi.org/10.11625/KJOA.2018.26.4.661

The Functional Effects on Anti-oxidant and Anti-inflammation of Veronica persica Poir. Extracts

Jin-Cheon Park, Hyeon-Hwa Nam, Li Nan**, Byung-Kil Choo***
*

First author, 전북대학교 농업생명과학대학 작물생명과학과


Corresponding author 전북대학교 농업생명과학대학 작물생명과학과(bkchoo@jbnu.ac.kr)
20180829 20180917 20180921

Abstract


Veronica persica (V. persica) is a perennial plant that is broadly distributed in Europe, Asia and so on. V. persica is used for pain about the lower abdomen and low back. The aim of this study was to investigate the anti-oxidant and antiinflammatory effects of V. persica ethanol extract in LPS-induced RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-oxidant activity, the DPPH and ABTS radical scavenging, total polyphenol and flavonoid contents, and reducing power activity were carried out. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were evaluated as 72.0% and 73.0% at the concentrations of 200 and 500 μg/mL, respectively. Total polyphenol and flavonoid contents of V. persica extracts were measured as 65.22 mg/g and 43.82 mg/g at the concentration of 1 mg/mL. The reducing power activity measurement showed 53.0% activity at 1 mg/mL. The anti-inflammatory effects of the V. persica extract were evaluated in LPS induced RAW 264.7 cells. In the evaluation of cell viability by proliferation & cytotoxicity assay kit, the cytotoxicity of the extract was not confirmed at 0~800 μg/mL concentration. And the V. persica significantly inhibited NO production in a concentration dependent manner. The inhibition effects of NO in cell medium of V. persica was over 80% at 800 μg/mL. The V. persica also suppressed the expression of iNOS, COX-2, and phosphorylation of NF-κB and IkB-α proteins. These results indicate that the V. persica has anti-oxidant and anti-inflammatory effects by modulating NF-κB signaling pathways and can be used as natural functional materials.



큰개불알풀 추출물의 항산화 및 항염증 기능성 평가

박 진천, 남 현화, 난 리**, 추 병길***
**전북대학교 농업생명과학대학 작물생명과학과

초록


    Ⅰ. 서 론

    우리 몸은 에너지를 얻기 위해 생화학적인 산화반응이 지속적으로 이루어지며 정상적인 세 포 내 대사과정뿐만 아니라 외부의 요인으로도 hydrogenperoxide, hydroxyradical, superoxide 와 같은 활성산소가 생성된다(Cha and Lee, 2004;Kim et al., 2016a). 과잉 생산된 활성산소 는 생체 내 산화 스트레스를 유발하고 노화, 암, 동맥경화, 심장질환 등을 초래하며 이와 같 은 질병을 예방하기 위해 다양한 치료제가 사용되고 있다(Hong et al., 2016). 현재 일반적으 로 사용되고 있는 항산화제는 천연 항산화제와 합성 항산화제가 있으며 대표적인 합성 항 산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA)과 butylated hydroxytoluene (BHT)은 장기간 복용할 경우 간 손상 및 발암물질과 같은 부작용을 동반할 수 있다(Chipiti et al., 2013).

    선천성 면역반응인 염증은 외부 이물질이 우리 몸에 침입하거나 상처가 발생하였을 때 신체를 방어해주는 중요한 과정으로(Yoon et al., 2015) 발열 및 통증과 같은 증상을 수반하 며 항상성 유지에 관여하는 대식세포에 의해 조절된다(Lee et al., 2015a;Lee et al., 2015b). lipopolysaccharide (LPS)의 자극으로 활성화된 대식세포는 nitric oxide (NO)와 prostaglandin E2 (PGE2)와 같은 염증 매개인자를 분비하며 이 매개인자들은 각각 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 통해 생성된다(Leem et al., 2011). 이 러한 염증성 단백질의 발현은 nuclear factor kappa-B (NF-κB) 신호 전달 경로에 의해 조절되 며, LPS로 인해 활성화된 전사인자 NF-kB는 다양한 염증성 매개인자 발현을 유도한다 (Sharif et al., 2007;Lawrence, 2009). 일반적으로 사용되고 있는 항염증제는 염증 세포의 활 성 억제 및 염증성 단백질의 생성 억제를 중점으로 하고 있으며, 현재 사용되는 대부분의 염증 치료제는 비스테로이드계와 스테로이드계와 같은 합성 항염제가 사용되고 있다. 그러 나 장기간 복용 시 소화불량 및 위․십이지장 궤양 및 출혈과 같은 증상을 유발할 수 있고 심하면 면역체계의 장애를 초래할 수 있다(Citterio, 2001;Seo et al., 2001;Sibi and Rabina, 2016). 이와 같은 이유로 식품 및 한약재로부터 천연 치료제를 얻기 위한 연구가 지속적으 로 이루어지고 있으며 천연 치료제는 비교적 안정적이고 다양한 생리활성 성분이 포함되어 있어 항산화 및 염증완화에 더 효과적으로 작용할 수 있다(Gautam and Jachak, 2009;Leem et al., 2011).

    큰개불알풀은 현삼과에 속하는 두해살이 귀화식물로 원산지는 유럽, 서아시아 등이며 양 지바른 밭이나 길가에서 흔히 볼 수 있다. 현재 큰개불알풀에 관한 생리활성 연구로는 큰 개불알풀에서 추출한 페닐에타노이드와 이리도이드 계통의 글리코시드가 암 치료에 중요 한 물질이라는 연구가 진행되었으며(Harput et al., 2002a), 당뇨병과 고혈압의 원인이 되는 효소를 농도 의존적으로 억제한다는 연구가 진행되었다(Sharifi-Rad et al., 2016). 또한 Harput 등(2002b)의 연구에서는 큰개불알풀 메탄올 추출물의 NO 생성 억제 활성이 보고된 바 있으나 큰개불알풀의 항산화 및 염증관련 생리활성에 관한 연구는 아직 미비한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 큰개불알풀 추출물에 대한 기본적인 생리활성을 정립하고자 항 산화 및 항염증 활성 평가를 실시하였으며, 이러한 기능성 평가를 통해 천연물 소재 및 기 능성 작물화의 가능성을 검토하고자 하였다.

    Ⅱ. 재료 및 방법

    1. 시료 채집

    본 실험에서 사용한 큰개불알풀은 2017년 5월 전북 전주 일대에서 자생하는 전초를 채취 하여 세척하였다. 세척한 후 45℃에서 음건하였고, 건조된 시료를 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.

    2. 추출용 시료

    추출용 시료를 만들기 위해 분쇄한 시료 10 g에 70% ethanol 100 mL를 넣고 2시간씩 3회 반복하여 환류 추출하였다. 추출물을 filter paper와 suction을 이용하여 여과한 뒤 용액을 rotary vacuum evaporator (JP/N-1000X, EYELA)를 사용하여 50~55℃ 수온에서 감압농축 하 였다. 이후에 농축된 용액을 초저온 냉동시킨 후 3~4일간 동결건조(fd5508, Ilshin)하였다. 건조가 완료된 시료는 -20℃에 보관하여 측정 시료로 사용하였다.

    3. 총 폴리페놀 함량 측정

    총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다(Chon et al., 2012). 25 μL의 시료와 10% folin-Ciocalteau’s phenol reagent 500 μL를 혼합하여 상온에서 5분간 방치시킨 후 7.5% sodium carbonate 500 μL를 가하여 30℃ incubator에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Elisa (multiscan spectrum, thermo scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 725 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 총 페놀 함량 측정을 위한 표준곡선은 gallic acid를 표준물질로 하여 작성 하였고, 표준곡선에 의한 식으로 시료의 총 페놀 함량을 측정하였다.

    4. 총 플라보노이드 함량 측정

    총 플라보노이드 함량은 Davis변법을 사용하여 측정하였다(Kim et al., 2016b). 시료 300 μL와 diethylene glycol 600 μL를 첨가하여 잘 섞어준 후 상온에서 차광하여 5분간 방치하였 다. 이후에 농도 1N의 NaOH 10 μL를 첨가하고 잘 혼합해준 다음 37℃ incubator (SANTO, Sakata, Japan)에서 1시간 차광하여 보관하였다. 반응이 끝난 후에 Elisa를 이용하여 420 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 rutin을 표준물질로 정하여 작성한 표 준곡선을 이용하여 측정하였다.

    5. DPPH radical 소거능 측정

    2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능은 추출물의 DPPH에 대한 수소공여 효 과로 측정하였다(Mathangi and Prabhakaran, 2013). Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 이용하여 제조한 시료를 증류수로 희석하여 농도별로 제조하였고 시료와 0.2 mM DPPH 용액을 1:1 (v/v) 비율로 혼합하여 37℃ incubator에 30분간 차광 상태로 방치하였다. 반응이 끝난 후 Elisa를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 DPPH 소거능은 시료를 첨 가하지 않은 대조구와 시료 첨가구를 비교하여 백분율(%)로 나타내었고 양성 대조구로는 ascorbic acid를 사용하였다.

    DPPH radical 소거능 = [ ( Ab-As ) /Ab ] ×100

    • Ab : 무처리구의 흡광도

    • As : 시료첨가구의 흡광도

    6. ABTS radical 소거능 측정

    2,2ʹ-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 라디칼 소거 능은 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate (K2S2O8)용액을 ABTS:K2S2O8=2:1 (v/v)로 섞은 후 12~16시간 차광하여 반응시켜 양이온(ABTS+)을 형성시키고 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 (±0.02)이 되도록 100% 에탄올로 희석하였다(Lee et al., 2015c). 48 well plate에 3반복씩 0.70 (±0.02)의 흡광도 값을 맞춘 용액 900 μL와 큰개불알풀 추출물 100 μL를 첨가하여 상온에서 3분 동안 차광하여 보관한 후 Elisa를 이용하여 흡광도를 측정하 였다.

    ABTS radical 소거능 = [ ( Ab-As ) /Ab ] ×100

    • Ab : 무처리구의 흡광도

    • As : 시료첨가구의 흡광도

    7. 환원력 측정

    환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 100 μL와 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 100 μL를 혼합하여 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 1% potassium ferrocyanide 100 μL를 첨가하여 섞어준 다음 20분간 50℃에서 가열하였다. 이후 10% trichloroacetic acid 100 μL를 가하여 동질화 한 다음 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 증 류수 100 μL, 상층액 100 μL 및 0.1% ferric chloride 10 μL씩 96 well plate에 가하여 Elisa 를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 1 mM rutin을 사용하여 환원 력을 측정하였다.

    8. 세포배양

    염증분석에 사용되는 대표적인 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cell을 American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, USA)로부터 구입하여 사용하였다. RAW 264.7 cell은 10% FBS와 1% penicillin (P/S) 100 U/mL + streptomycin sulfate (100 μg/mL)가 들어있는 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator (SANTO, Sakata, Japan)에서 배양하였다.

    9. 세포 생존율

    큰개불알풀의 독성을 평가하기 위해 proliferation & cytotoxicity assay kit를 이용하였다. 96 well plate에 5×105 cells/mL를 seeding한 후 추출물을 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도로 처 리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 반응시켰다. 2,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상 층액을 분리한 다음 proliferation & cytotoxicity용액을 처리하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 30분 반응시킨 후 Elisa를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

    10. NO 생성량

    Lipopolysaccharide (LPS)에 의해 활성화된 대식세포 RAW 264.7 cell의 배양액 중에 존재 하는 nitrite (NO2-)의 양을 Griess 반응을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다. 96 well plate에 RAW 264.7 cell 5×105 cells/mL를 seeding한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 사용하였다. 분주한 세포에 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도의 추출물을 처리하고 1시간 방 치한 다음 LPS 1 μg/mL을 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 반응시키고, 다음으로 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine)에 기초하여 배양액 중 의 NO를 분석하였다. 표준물질로 sodium nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 cell이 생성한 NO의 양을 평가하였다.

    11. Western blotting

    LPS에 의해 활성화된 대식세포 RAW 264.7 cell에 존재하는 염증성 단백질 발현량을 측 정하기 위해 western blotting을 수행하였다. Cell culture dish에 RAW 264.7 cell을 1×106 cells/mL을 seeding한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 사용하였다. 분주한 세포에 400, 800 μg/mL 농도의 추출물을 처리하고 1시간 동안 방치한 다음 LPS 1 μg/mL를 처리하 여 37℃, 5% CO2 incubator에서 18시간 동안 반응시켰다. 이후에 배양액을 모두 제거하고 phosphate buffer saline (PBS)을 이용하여 washing 해준 뒤 scrapper로 세포를 수집한 후 4℃ 에서 4000 rpm 속도로, 3분 동안 원심분리 하였다. 수집한 cell에 lysis buffer를 첨가하여 단 백질을 추출하였다(Kim et al., 2010). 추출된 단백질은 bio-rad protein assay reagent A and B (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 정량하였고, blue-buffer를 첨가하여 loading sample을 제조 하였다. 각 sample은 running gel과 stacking gel을 이용하여 8% 및 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하였다. 분리된 gel을 membrane 으로 transfer하였고 5% Skim-milk로 실온에서 1시간 30분 동안 blocking하였다. 이후에 1× phosphate buffer saline/Tween (PBST)을 이용하여 5회 세척 후 염증성 단백질(iNOS, COX-2), 전사인자(p-p65, p-IKba), house keeping gene (β-actin)의 1차 항체(Santa Cruz, CZ, USA)는 4℃에서 overnight 반응시켰다. 다음날 1×PBST로 5회 세척 후 실온에서 2차 항체(Santa Cruz, CZ, USA)를 2시간 반응시킨 후 1×PBST로 세척하였고 membrane을 X-ray films에서 발색시약 A, B를 1:1 (v/v)로 혼합하여 도포하고 Chemi DocTM MP imaging system (Bio-Rad, California, USA)을 이용하여 관찰하였다.

    12. 통계처리

    모든 실험에 대한 결과는 3반복으로 측정하여 평균과 표준편차로 나타냈으며, 각 데이터 의 통계 분석은 T-test를 사용하여 통계적 유의성을 나타내었다.

    Ⅲ. 결과 및 고찰

    1. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

    다양한 구조와 분자량을 가지는 페놀성 화합물은 식물계에서 흔히 함유하고 있는 2차 대 사산물 중 하나이다(Jun et al., 2009). 페놀성 화합물의 구조적 특징으로 방향족 고리에 Phenolic hydroxyl (OH)기를 소유하기 때문에 단백질 및 큰 분자들과 결합이 용이하며 활성 산소를 제거하는 항산화 물질로 잘 알려져 항산화, 항암 등과 같은 다양한 생리활성에 효 과가 있다(Lee and Lee, 2016). Gallic acid를 표준물질로 하여 측정한 큰개불알풀 에탄올 추 출물의 총 폴리페놀 함량은 65.22 mg/g으로 측정되었다(Table 1). Harput 등(2011)의 연구에 서는 큰개불알풀 메탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량이 82 mg/g 함유하고 있다고 보고된 바 있다.

    2개의 방향족 고리와 3개의 링이 결합한 구조(C6-C3-C6)를 가지는 플라보노이드는 페놀 성 화합물로 대부분 식물에서 합성되어 당과 결합된 배당체로 존재한다. 플라보노이드 화 합물도 페놀성 화합물과 마찬가지로 활성산소종을 효과적으로 제거하는 능력이 뛰어나 항 염 및 항암과 같은 생리활성을 가진다(Jeon et al., 2013). 큰개불알풀의 플라보노이드 함량 을 측정한 결과 43.82 mg/g을 함유하고 있는 것으로 나타났다(Table 1). 페놀성 화합물의 범 주로 포함되는 플라보노이드는 대부분의 작물에서 페놀 함량이 플라보노이드 함량보다 더 높게 나온다는 연구 결과가 있으며 본 연구도 이와 비슷하게 총 페놀함량이 플라보노이드 함량보다 높게 나타났다(Joo, 2013).

    2. DPPH 및 ABTS radical 소거능

    DPPH radical 소거능은 전자공여작용에 의한 polyhydroxy 방향족 화합물 및 방향족 아민 류 등이 환원되는 것을 지표로 평가하는 방법이다(Lee et al., 2015c). 안정적인 free radical의 형태인 DPPH는 항산화 물질과 반응하게 되면 전자를 내어주는 환원반응이 이루어지며 최 종적으로 radical이 소멸된다. 이러한 과정에서 DPPH 고유의 짙은 자색이 노란색으로 변하 게 되며 항산화 능력이 높을수록 탈색이 잘 이루어진다(Kim et al., 2016c). 큰개불알풀의 항 산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 표준물질인 ascorbic acid 는 200 μg/mL 농도에서 79.6%의 소거능을 보였으며 큰개불알풀 추출물은 25, 50, 100, 200 μg/mL 순으로 농도 의존적으로 증가하여 각각 13.8%, 27.9%, 48.7%, 72.0%의 소거능을 나 타냈고, 200 μg/mL 농도에서 ascorbic acid와 유사한 소거활성을 보였다(Fig. 1A). Harput 등 (2011)은 큰개불알풀 메탄올 추출물의 154.49 μg/mL에서 DPPH radical에 대한 50% 이상의 억제율을 나타냈다고 보고하였다. 본 연구결과와 비교하였을 때 큰개불알풀 에탄올 추출물 의 DPPH radical에 대한 소거활성이 메탄올 추출물에 비해 높은 것으로 확인되었다.

    ABTS와 potassium persulfate를 어두운 곳에 함께 방치하면 청록색을 띠는 ABTS+・을 형 성하며 이는 다른 물질들의 항산화 능력에 의해 radical이 소거되면서 청록색이 탈색되는 정도로 흡광도 값으로 나타내어 항산화 능력을 평가하는 방법이다(Sim et al., 2017). 본 실 험에서 큰개불알풀 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 125, 250, 500 μg/mL에서 각각 24.3, 43.1, 73.9%로 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1B). Youn 등(2015)과 Joo (2013)의 연구에서 여러 가지 약용작물들을 70% 에탄올로 추출하여 ABTS radical 소거능을 평가한 결과, 500 μg/mL 농도에서 갈근, 쇠비름, 참빗살나무의 ABTS radical 소거능이 각각 49, 30.31, 52.58%로 나타나 큰개불알풀이 다른 약용작물보다 같은 농도에서 다소 높은 ABTS radical 소거 활성을 나타내는 것으로 판단되었다.

    3. 환원력

    항산화 활성이 높으려면 다른 물질에 대한 환원능력이 높아야 하며 환원력은 항산화 활 성을 측정하는 방법의 지표가 된다. 금속이온을 환원시켜 항산화 능력을 평가하는 reducing power activity는 환원력이 강할수록 짙은 녹색에 가까워 높은 흡광도 값을 가진다(Kim et al., 2015). 본 실험에서 rutin 1 mM을 표준물질로 하여 측정한 결과, 큰개불알풀의 환원력은 250, 500, 1000 μg/mL에서 농도 의존적으로 증가하여 각각 30.3, 36.5, 53.0%로 나타났다. 특 히 항산화제로 쓰이는 표준물질 1 mM rutin (100%)과 비교하였을 때 큰개불알풀의 환원력 은 1000 μg/mL 농도에서 50% 이상의 환원력을 나타냈다(Fig. 2).

    4. 세포 생존율

    큰개불알풀 추출물이 세포 생존율에 영향을 주는지 확인하기 위해 proliferation & cytotoxicity assay kit를 이용하여 독성평가를 실시하였다. 측정 결과 추출물 0, 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도에서 RAW 264.7 cell 생존율이 모두 100% 이상으로 큰개불알풀 추출물은 세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 3).

    5. NO 생성량

    적절한 수준의 NO 발현은 인체 내에서 면역반응, 신경전달, 혈관확장 등의 주된 생리적 역할을 수행하지만 과도한 NO 발현은 염증유발 및 조직손상을 야기하는 등 병리적 반응의 지표가 된다(Kim et al., 2016d). 큰개불알풀 추출물의 NO 생성 억제 활성을 평가하기 위해 대식세포인 RAW 264.7 cell에 염증유발 물질 LPS를 처리하여 cell에서의 NO 생성 정도를 측정한 결과, 정상군에 비해 LPS를 처리한 대조군에서 NO의 생성이 현저히 증가하였으며 LPS와 큰개불알풀 추출물을 함께 처리한 세포에서 농도 의존적으로 억제되어 100, 200, 400, 800 μg/mL 에서 NO 생성이 각각 92.0, 86.9, 54.7, 12.9%로 억제되는 경향을 확인하였 고 특히 800 μg/mL 농도에서 80% 이상의 높은 억제율을 나타냈다(Fig. 4).

    6. iNOS 및 COX-2 단백질 발현량

    LPS에 의해 유도된 대식세포 RAW 264.7 cell에서의 염증반응은 다양한 인자들이 관여하 며, 염증반응에서 NO 및 PGE2와 같은 매개물질이 분비되고 이는 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2에 의해 발현된다. iNOS에 의한 NO의 과도한 생성은 염증을 유발하여 다양한 질병 의 원인이 되고, 또 다른 염증촉진인자인 COX-2에 의한 PGE2의 생성 증가는 통증 및 발열 과 같은 염증 반응을 촉진시킨다(Kim et al., 2017;Lee et al., 2017). 이에 본 연구에서는 LPS로 자극된 RAW 264.7 cell에서 큰개불알풀 추출물 처리가 염증 반응물질 생성과 관련 된 효소인 iNOS와 COX-2 단백질 발현량을 western blotting을 통해 확인하였다.

    RAW 264.7 cell에 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL 농도별로 처리한 뒤 LPS 처리와 함께 18시간 반응 후 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과는 다음과 같다. LPS에 의해 유도 된 iNOS의 발현량 측정 결과, LPS 처리구에서 무처리구에 비해 유의하게 발현이 증가하였 고 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 농도가 증가할수록 iNOS 발현량 이 유의하게 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 5A). 또한 PGE2 합성에 영향을 미치는 COX-2의 발현량은 LPS만 처리한 세포에서 무처리구에 비해 30배 이상 발현이 증가하였는데 큰개불 알풀 추출물을 400, 800 μg/mL으로 처리하였을 때 발현량이 각각 27, 23배로 농도 의존적 으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 따라서 큰개불알풀 추출물은 LPS로 활성화 된 대식세포 RAW 264.7 cell에서 NO 생성 및 iNOS와 COX-2 염증성 단백질 발현 억제를 통해 항염증 효과를 보이는 것으로 확인되었다.

    7. p-NF-κB p65 및 p-IkB-α 단백질 발현량

    염증성 매개물질 발현에 중요한 신호전달체계인 NF-κB p65는 염증반응을 유도하는 전사 인자로서 보통 세포질에 IkB-α와 단백질 복합체를 이루어 존재하지만 LPS 및 박테리아 등과 같은 외부자극에 의해 활성화 되면 IkB-α가 인산화 되어 복합체 분리가 일어나고 인산화 된 NF-κB p65는 세포질에서 핵 내로 이동하여 iNOS와 COX-2와 같은 염증성 단백질의 전사를 촉진시킨다(Jeon and Kwon, 2016;Kim and Kim, 2016). 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서 큰개불알풀 추출물에 의한 전사인자 p-NF-κB p65와 p-IkB-α의 발현량 변화 를 측정하였다. p-p65와 p-IkB-α의 발현량을 확인한 결과 p-p65의 발현량은 LPS를 처리한 실험군에서 1.4배 정도 증가하였고 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 각각 1.2, 1.0배로 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 6A). 또한 p-IkB-α 의 발현량은 무처리구에 비해 LPS를 처리한 실험군에서 1.21배의 발현량을 나타내었고, 큰 개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 각각 1.18, 1.11배로 농도 유의하게 발현 량이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 6B).

    이러한 결과로부터 큰개불알풀 추출물의 유의적인 항산화 능력을 검정할 수 있었고, LPS 로 유도된 RAW 264.7 cell에서 독성 없이 전사인자 NF-κB의 활성 조절을 통해 염증성 단 백질 iNOS와 COX-2의 발현, 염증매개인자 NO의 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 보이 는 것으로 확인되었다.

    Ⅵ. 적 요

    본 연구는 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 활성과 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에 서의 항염증 활성 효과를 확인하기 위하여 수행되었다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 을 측정한 결과 추출물 1 mg/mL의 농도에서 각각 65.22 mg/g, 43.82 mg/g 함유하고 있음을 확인하였고 DPPH와 ABTS radical 소거능 측정 결과, 농도 의존적으로 소거능이 증가하였 고 200 μg/mL, 500 μg/mL 농도에서 72.0%, 73.9%의 소거활성을 확인하였다. 환원력 측정 결과에서도 큰개불알풀 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였고, 1000 μg/mL 농도 에서 53.0%의 환원력을 나타내었다. 세포독성 측정을 위한 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell 세포생존율 측정 결과, 큰개불알풀 추출물 0~800 μg/mL에서 세포독성이 나타나지 않았으 며, NO 생성 억제활성은 추출물 800 μg/mL 농도에서 NO 생성량이 80% 이상 억제됨을 확 인할 수 있었다. 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2 발현량을 측정한 결과, 모두 농도 의존적 으로 억제되는 경향을 보였고, 특히 iNOS는 800 μg/mL 농도에서 LPS 처리군에 비해 50% 정도 억제되었다. LPS로 인한 NF-κB p65와 복합체 단백질인 IkB-α의 인산화 수준 또한 농 도 의존적으로 억제되었으며, 특히 인산화 된 NF-κBp65는 800 μg/mL 농도에서 정상군과 같은 발현량을 보였다. 이와 같이 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 및 항염증 활성의 생리활성 평가를 통해 천연 기능성 소재로서 활용 가능성을 확인하였으며 추후 생리활성을 나타내는 유효성분 탐색 및 분리 연구가 필요할 것으로 판단된다.

    Figure

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    Anti-oxidant activity of V. persica ethanol extracts by DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging. Each value is mean±SD of triplicate different at ***p < 0.001.

    KJOA-26-661_F2.gif

    Anti-oxidant activity of V. persica ethanol extracts by reducing power activity. Each value is mean±SD of triplicate different at ***p < 0.001.

    KJOA-26-661_F3.gif

    Cell cytotoxicity of V. persica ethanol extracts on LPS-induced RAW 264.7 cells.

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    NO production of V. persica ethanol extracts on LPS induced RAW 264.7 cells. Data are means ± standard deviation; ###p < 0.001 compared with normal control. ***p < 0.001 and **p < 0.01 compared with LPS control.

    KJOA-26-661_F5.gif

    Inhibitory effect of V. persica ethanol extracts on iNOS (A) and COX-2 (B) proteins expression in LPS induced RAW 264.7 cells. Data are means ± standard deviation; ###p < 0.001 compared with normal control and *p < 0.05 compared with LPS control.

    KJOA-26-661_F6.gif

    Inhibitory effect of V. persica ethanol extracts on p-p65 (A) and p-IkB-α (B) proteins expression in LPS induced RAW 264.7 cells. Data are means ± standard deviation; ##p < 0.01 and #p < 0.05 compared with normal control. **p < 0.01 and *p < 0.05 compared with LPS control.

    Table

    Total polyphenol and flavonoid contents (mg/g±SD) in V. persica

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